大肠杆菌抽取RNA

    之前已分别构筑出GUS 基因的表现质体pQG，要启动子T5promotor 的启动受到好的调控，应进一步将pQG 转形至大肠杆菌M5[pREP4]。 M5[pREP4] 可持续表现lac repressor，pQG 上用以驱动GUS基因表现的T5 promoter 的活性将因而受到抑制，细胞但一旦加入IPTG 就能诱导GUS基因大表现。 在这一节的实验里，我们将分别自经IPTG 诱导与未经诱导的pQG/M5[pREP4] 菌体抽取total RNA，以以方杂合反应分析GUS mRNA的表现情形。

    下面所采用的方法适用于大肠杆菌及其他革氏阴性菌total RNA的抽取，实验进时先以lysozyme 分解细胞壁，再以sodium dodecyl sulfate （SDS）解原生质膜 （Summers, 970; Ausubel et al., 2005）；的后加入适的氯化钠溶液将SDS、蛋白质及大肠杆菌的染色体DNA 一并沉淀下，并以离心法移除，存于上清液的RNA 则以酒沉淀。 实验过程所使用的RNase 抑制剂为DEPC。

    仪器用具：恒温震荡培养箱37℃；冰浴；微离心机；分光光计 （Hitachi U-00 spectrophotometer）

    药品试剂：大肠杆菌菌株pQG/M5[pREP4];LB 培养液;Ampicillin （00 mg/mL）;Kanamycin （25 mg/mL）;IPTG （ M）;Protoplasting buffer （5 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0.45 M sucrose; 8 mM EDTA, stored at 4℃）;Lysozyme （50 mg/mL）;Gram-negative lysing buffer 细胞（0 mM Tris-HCl, pH 8.0; 0 mM NaCl; mM sodium citrate; .5% SDS）;Diethylpyrocarbonate （DEPC）;饱和氯化钠溶液 （以40 g氯化钠溶解于00 mL dH2O/DEPC）;酒及70%酒