检测抗原特异性IgE抗体的方法

有两种方法用来检测抗原特异性IgE抗体：（）IgE抗体检测，前面称为放射免疫吸附试验（2）淋巴细胞组胺释放试验。描述淋巴细胞组胺释放试验是在50多年以前，随后它被改进和自动化。22-25先用葡聚糖沉淀法分离外周血淋巴细胞，洗涤，用含钙和镁离子的缓冲液悬浮。往洗涤过的固定量的淋巴细胞中，加入不同浓度的变应原提取物，混合物在37℃孵育一小时。4℃冷却试管以终止反应，通过离心分离细胞。变应原与结合在细胞上的IgE抗体发生反应后，嗜碱细胞释放组胺至上清液，先用丁烷再用酸提取组胺。可用荧光分光光度计或RIA方法检测提取物中的组胺浓度。26.27手工操作的荧光分光光度计法，可检测大约ng的组胺。RIA法更敏感。用细胞释放的组胺占组胺总浓度的百分比来表示结果，将未接触过变应原提取物的淋巴细胞溶于高氯酸，然后在该细胞溶解产物中检测组胺的总浓度。

淋巴细胞组胺释放试验详细说明了结合在细胞上的IgE抗体的特异性，也表明了释放介导因子的机制在功能上的完整。大约5%的个体，他们的淋巴细胞在体内不释放组胺。28尽管已发展了自动化系统来检测组胺，但组胺释放试验的临床应用仍然有限，因为它要求使用新鲜血液，而且，仅单独使用血液的一部份就能检测出的变应原也很有限。29还有，用这些方法测定组胺时，存在相当大的室内实验室差异。

IgE抗体检测是一个双位点IMA。3该方法的*阶段：IgE抗体待测的血清标本与固相结合的变应原免疫吸附剂反应。第二阶段：2-4小时后，冲掉没有抗体的血清部份，变应原与放射性标记或酶标，及经亲和力层析法纯化的抗体或单克隆抗-IgE抗体一起孵育。第二阶段的抗-IgE抗体与变应原免疫吸附剂的结合，可以检测在*阶段被结合的抗体。

IgE抗体检测并没有测出IgE抗体的实际浓度。许多过敏性个体的血清，含的抗体浓度都超过变应原免疫吸附剂的结合能力，因而*阶段孵育的上清液中，含有过剩的IgE抗体。32而且，由于大多数变应原都是复杂的蛋白质或糖化蛋白，所以，各血清包含的是能以不同的亲和力与变应原反应的抗体混合物。而且，在一限定的范围，第二阶段抗体的结合与血清里的IgE抗体浓度成比例。这层关系已在用校正的标准曲线定量测定IgE抗体的研究应用中被用到。33.34然而，由于常规的IgE抗体检测，IgE抗体通常都过量，第二阶段抗体的结合不仅反映了待测抗体的量，还反映了它的亲和力，因此，结果是半定量的。

正如前面Wide等人3描述的那样，IgE抗体检测使用了与交联匍聚糖珠粒共价结合的变应原。随后人们又使用了各种别的固相材料，34.35包括纤维素载体，微晶纤维素颗粒，琼脂糖珠子，滤纸，多聚乙烯小杯或微量滴定孔。这些固相材料大多都是带有游离氢氧根的多醣类，该氢氧根能与溴化氰反应形成稳定的咪多卡中间物。36后者与蛋白质变应原的氨基部份反应形成共价键。与多聚乙烯孔或小杯的结合是非共价吸附。临床实验用时，变应原免疫吸附应该含有原始变应原提取物的所有免疫源性成份，并且与复杂的变应原具相同比例。虽然监测蛋白质与固相发生化学结合，相对来说比较容易，但在不同的变应原系统，很少有这样一些数据提供，即能够表明所有的相关变应原都被结合上了。Alternaria变应原已被具体地研究过，吸附研究表明，所有相关的免疫源性成份都被结合到了固相免疫吸附剂上。用固相免疫吸附剂吸附0个Alternaria过敏病人的血清，该血清池的皮肤致敏活性将丧失。37确保所有相关变应原都与固相免疫吸附剂结合上的另一方法就是，用含变应原的溶液与化学活化的微粒子免疫吸附剂结合。38冲洗，悬浮吸附试剂，从对还在疑问当中的变应原过敏的几个个体中得到血清，然后用这些不同量的血清来检测，从而得到一系列剂量反应曲线。当所有的变应原都固相免疫吸附剂结合后，剂量反应曲线变平。这点之前制备的各免疫吸附剂搭配后产生zui终的固相免疫吸附剂。

如前所述，商业上已提供了好几种类型的变应原免疫吸附剂。商业提供的zui普遍的是使用纤维载体或免疫吸附盘，但小杯型的免疫吸附剂如微量滴定孔，也有提供。无论使用哪一型试剂，在技术上都很方便。因为在测定过程中，不需要离心。试剂一旦配置好，都很稳定。

IgE抗体检测的分析灵敏度部份是由第二阶段使用的标记的抗-IgE抗体决定。商业上放射性标记、亲和力层析纯化的抗-IgE抗体作为蛋白质的检测，效果很好，可以定量检测ng的IgE抗体。39为了循环使用放射性标记的抗-IgE抗体，商业制造商已发展了使用酶连抗体的免疫方法。这些方法的分析特征跟旧的RIA方法相似。放射性标记的单克隆抗体在商业上也有提供。

几乎所有的常见变应原（包括动物上皮细胞，食物，霉菌，尘，昆虫毒液，一些药物，以及牧草、野草和树木的花粉）都被提供用于IgE抗体的检测。大多数药物都低分子量的复合物，没有游离的氨基部份，不会与溴化氰活化的固相起反应。然而，有些低分子量的药物，如胰岛素，却能与之结合并制成令人满意的免疫吸附剂。至于，Penicilloyl可以与Polylysine或蛋白质载体结合，后者又可与活化的固相结合，以用于IgE抗体的检测。40还没提供有类似的试剂，用于检测这类IgE抗体的检测，即抗所谓的微量抗原性决定物，该物质可能与一些急性过敏反应有关。

如更前面所谈到的，IgE抗体检测不是定量的免疫测定，结果的描述也很复杂，因为有好几种公式可以用来给结果记分和报告结果。大多数商业上提供的、以结果的得分情况为根据的方法，都是以与病人剂量反应曲线数据做对比为根据。两种方法zui常用：把一系列阳性质控物的稀释液与变应原免疫吸附剂一起孵育，得到参考曲线；或用结合抗-IgE抗体的免疫吸附剂去捕获标准液中的IgE，该标准液中一已知量的IgE蛋白质。（如25U/ml）。无论哪一种情况，都要定义一个阈值，用来表示IgE与固相的非特异性结合（阴性）和gE与免疫吸附剂的变应原特异性结合（阳性）之间的临界值。定量表示结果可以用单位/毫升，半定量表示是从0级（阴性）- 6级（强阳性），或用比率来表示：待测血清的结合跟同一方法检测到的非过敏个体血清池的结合相比。理论上，zui后这种方法比较合适，因为不可能假设每一个抗体-变应原系统都产生相同的剂量反应曲线。

除了随机误差，还有别的原因导致IgE抗体检测的结果有误。IgE蛋白质水平增高的血清和许多变应原免疫吸附剂一起检测的时候，由于非特异性结合的增加，血清会产生临界或弱阳性结果。IgE浓度低于000 U/ml时不会出现这种现象，除非把阴性和阳性的分界点设在很低的水平。42由于IgG抗体对IgE抗体结合的抑制，可能出现假阴性结果。43IgG抗体的亲和力与IgE抗体相似，而且，在免疫治疗中的病人身上，通常以ng/ml的浓度出现。44IgE抗体的检测，对判定已接受治疗的病人身上是否还有临床过敏性存在作用不大，在未接受过治疗的病人身上，很少发现有高水平的IgG抗体。

由于没有*可靠的参考方法来定义一个变应原的敏感性，所以很难定义IgE抗体的诊断灵敏度和特异性。但很多的临床研究，都把IgG抗体检测的结果与体内诊断试验（皮肤测试，吸入抗原或两者）和过敏性疾病家族史做对比。从这些研究中可以很清楚地看到：由于接触抗原与检测的间隔时间不同、变应原种类不同、病人年龄以及受影响的靶器官不同，使得诊断灵敏度有相当大的变化。更重要的是，IgG抗体检测的敏感性与临床敏感性成正比。不考虑变应原或过敏性疾病，对变应原显著过敏的个体，IgG抗体检测的结果可能为阳性，而在具轻微过敏性的个体中可能为阴性。

在不同的变应原系统中，许多研究都支持这样一个结论：对变应原具有轻微过敏的个体，皮肤试验比IgE抗体检测更敏感。然而，也有许多类似的研究表明，用阳性内脏激发试验，皮肤测试里很大一部份的弱阳性不能被确认。这种讨论有点不切实际：对变应原显著过敏的病人，无论皮试还是IgE抗体实验，都很可靠，而对轻微程度的临床过敏，两者都不是*可靠。

与皮试相比，检测IgE抗体有一定的优势：它方便；对病人没有危险；结果不受药物治疗的影响。除此之外，对某些群体的病人，更应使用IgE抗体检测而不是皮试：如婴幼儿、皮肤划纹症病人或全身性皮肤炎病人。IgE抗体检测也有不足：血清学实验比皮试昂贵而敏感性却不如它，且不能立即出结果。
皮试可用多种变应原，与此相比，多种IgE抗体的检测,所需要的花费却限制了它作为过敏性疾病筛选的用途。近年，人们通过改进IgE抗体的测定方法，发展了多变应原IgE抗体检测，它可能更有效。多变应原IgE抗体检测是在同一试管中，加入多种变应原的免疫吸附剂，或使用已结合多种变应原的吸附剂。多变应原方法分析的敏感性可与单变应原方法相比。对鉴别吸入性变应原导致呼吸道变态反应的孩子，多变应原方法的诊断敏感性比IgE抗体检测更高，46 当然，要证明该实验筛选过敏性疾病的临床用途，还需更多的研究。