免疫印迹的检查过程

检查过程

() 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-min。然后4℃，3,000g离心5min。取上清液作为样品。

(2) 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。　

(3) 转移：(半干式转移)

① 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。

② 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中0min。

③ 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流mA/cm2，转移.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。

(4) 免疫反应：　

① 用0.0M PBS洗膜，5min ×3次。

② 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。　细胞

③ 弃包被液，用0.0M PBS洗膜，5min×3次。　

④ 加入一抗(按合适稀释比例用0.0M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃ 放置2hr以上。阴性对照，以%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。　

⑤ 弃一抗和%BSA，用0.0M PBS分别洗膜，5min×4次。　

⑥ 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.0M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。　

⑦ 弃二抗，用0.0M PBS洗膜，5min×4次。　

8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。细胞