四噻唑蓝实验方法

    四噻唑蓝(methylthiazoletetrazolium，MTT)法被广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测。MTT为黄色化合物，可被活细胞线粒体内的脱氢酶还原生成不溶于水的蓝紫色结晶甲臌(formazan)，后者沉积在细胞中，而死亡细胞则无此酶活性而无此过程。在一定细胞敷范围内甲躜结晶的形成量与活细胞数成正比。生成的结晶产物可被二甲基亚砜(DMSO)溶解(也可以用含50％的N，N一二甲基甲酰胺和20％的pH 4．7的十二甲基磺酸钠的MTT溶解液溶解)，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。

(一)材料

．待测细胞：96孔培养板培养24~72h的成层细胞。(按04／200μl／孔接种细胞)。

2．MTT溶液：5mgMTT溶于lml培养液(与所用的培养细胞液相同，不含酚红)、

3．0mol／L PBS(pH7．2)或生理盐水中。0．2μm滤膜除菌后，分装，4℃保存，两周内有效。冻存可保存更长时间。使用时可配成2mg／ml浓度。MTT粉末和溶液均需避光保存。

3．DMSO(分析纯)。

4．96孔培养板，可调移液器，吸管，离心管。

5．CO2孵箱，显微镜，微型振荡器，酶标仪。

(二)方法

．弃去细胞培养板中培养液。

2．每孔中加入50μl(2 mg／ml)MTT溶液，继续培养3～4h。

3．终止培养，小心吸弃(或倒置培养板)孔内培养上清液，如为悬浮细胞离心后吸弃上清液。每孔加入50μl DMSO，在微型振荡器上震荡5~0min，使结晶充分溶解。

4．比色：选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD值)，记录结果。

(三)结果分析

    细胞存活率=实验组吸光度值÷对照组吸光度值×00％。如果是药物试验，以药物浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制率曲线。

    绘制生长曲线：以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞的生长曲线。

(四)注意事项

．选择合适的细胞浓度，培养终止时细胞密度不宜过大，这样才能保证MTT结晶形成的量与细胞数呈良好的线性关系。

2．避免高浓度的血清物质影响实验孔的光吸收值，一般选低于0％胎牛血清的培养液进行实验。

3．设空白对照。与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，其他试验条件保持一致，比色时，以空白对照孔调零。