溶血空斑形成试验

    溶血空斑形成试验(plaque forming cell assay)是体外检测和计数B细胞功能的一种常用方法，即检测空斑形成细胞(plaque-formiilg cell，PFC)，反映B细胞产生抗体的功能。当B细胞受抗原或有丝分裂原刺激后，可分化增殖为浆细胞，并分泌抗体。B细胞功能减弱或缺陷，可表现为抗体形成细胞减少及血清Ig量的减少。PFC检测方法很多，有琼脂固相法、盖玻片法、小室液相法、单层细胞法等。

.20%SRBC悬液(用Hank’s液配制)。

2．补体取3只豚鼠的新鲜血清混合，取压积SRBC，按SRBC与豚鼠血清：4～：6的比例加入压积SRBC，混匀，置4℃冰箱30min，2000r／min离心20min去除SRBC，以吸收豚鼠血清中可能存在的抗SRBC抗体，防止假空斑的出现。

3．底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂，用PBS配成．4％和O．7％两种浓度。

4．DEAE右旋糖酐分子量50万，用蒸馏水配成％浓度备用。

(三)方法

免疫脾细胞悬液的制备

．免疫小鼠：每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRB(：悬液ml。

2．制备脾细胞悬液：将免疫后第四天的小鼠．拉颈处死，解剖取出脾脏，放人含Ca 2+ 、Mg 2+冷的pH值7．2 PBS中漂洗后，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用弯头镊子挤压出脾细胞，稍静置，吸上清液至离心管中，500r／min离心5min，弃上清液后，定量加入PBS，混匀，按白细胞计数法计算脾细胞，zui后用PBS调整细胞数至07／ml的浓度。一般每只脾脏细胞数为～．5×08个。

3．倾注底层琼脂将．4％琼脂凝胶经加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿2～3ml，凝固后，置37℃温箱，平皿反扣，开盖lh后备用。

4．顶层琼脂的制备将0．7％的琼脂融化后，置于45℃恒温水浴箱中，依次加入：①2×09／ml SRBC悬液O． ml；②％DEAE有旋糖酐0．05ml；③07／ml脾细胞悬液O． ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺开，凝固后，静置约5min，放37℃温育～．5h。

5．加补体从温箱中取出平皿，每皿加入：30稀释的新鲜豚鼠血清．5ml(如未加DE—AE右旋糖酐，则加原血清或：5稀释的新鲜血清．5ml)，继续放37℃温箱中温育30min后，取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置lh，4℃冰箱过夜，翌日观察结果。

(四)结果分析

    肉眼观察可见空斑为边缘整齐的圆形透明区，如肉眼难以分辨，可在低倍镜下鉴定，空斑的有淋巴细胞，周围为透明区。一个空斑代表一个PFC，计数每块玻片的空斑数，算出每个脾脏中PFC数。