实体组织材料的分离方法

实体组织材料的分离方法

    对于实体组织材料，细胞间结合紧密，可采用机械分散法和消化分离法使组织中的细胞宽分分散，形成细胞悬液。

(一)机械分散法

    机械分散法，指通过各种各样的物理学处理手段，将所取得动物组织解离成为单个细胞药方法，包括切割分离法和机械分散法。

．材料

()标本：各类实体组织材料。

(2)试剂：Hanks液、培养液。

(3)器具：手术刀、眼科剪、不锈钢(rg龙)的筛网、平皿、三角烧瓶。

2．机械分散的操作步骤

()切割分离法：无菌切取cm3一块组织，置人小烧杯中，左手斜持容器，右手持长柄眼科剪伸入容器中，反复剪切组织至lmm3大小，用吸管吸取Hanks液把附着在剪刀上的组织小块冲下。并再补充适量的Hanks液后，用吸管反复轻柔吹打片刻，低速离心，弃上清液，余下的组织块可用于细胞培养。

(2)机械分散法：所取标本是纤维成分很少的软组织，如脑组织，部分胚胎组织及一些肿瘤组织。将组织块处理成小块后，可将组织放在注射器针管中挤压或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差，仅适用于处理纤维成分少的软组织。

(二)消化分离法

    消化分离法是把切成较小体积，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步分散组织的方法。zui后使被处理的组织分散成细胞团或单个细胞，加入培养液后制成细胞悬液，接种入培养容器中后，细胞容易生长繁殖。各种消化剂作用机制各不相同，根据组织的不同．可选用特定的消化手段。使用的消化剂包括酶类和非酶EDTA。

．消化分离法种类

()消化法：(简称)是广泛应用的消化剂。对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。适于消化细胞问质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。钙、镁离子对的活性有一定的抑制作用，凶此，采用无钙、镁离子的PBS。一般采用的浓度为0．％～0．25％(活力l：200或：250)。常使用的消化温度为37℃，消化分离细胞时pH适宜选用7．6～8．0之间，否则对细胞有损伤。消化5mm3大小的软组织，消化时间为20~30min为宜，但遇到难消化的组织时，浓度可适当提高，消化时间适当延长至数小时。可采用冷消化，使用低浓度消化液，于4℃过夜。

(2)胶原酶消化法：胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，同时对细胞间质有较好的消化作用，而使细胞不受伤害。该酶在有钙、镁离子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培养液配制，zui终浓度200U／ml或0．～O．3μg／ml。此酶消化作用缓和，无需机械振荡，但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。

    由于上皮细胞对酶有耐受性，经过胶原酶消化后的上皮组织，可能有一些上皮细胞团块尚未被*消化开。成小团块的上皮细胞比分散的单个上皮细胞更易生长，因此不必要冉进一步消化处理。

(3)EDTA消化法：EDTA是一种非酶消化物。常用不含钙、镁离子的PBS配成0．02％工作液，对一些组织．尤其是上皮组织分散效果好。EDTA能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。EDTA常不单独使用，可与混合使用(：或2：)，不仅利于细胞脱壁又利于细胞分散，可降低的用量和毒性作用。

2．材料

()标本：各类实体组织材料。

(2)试剂：消化液、PBS、Hanks液、培养液。

(3)器具：眼科剪、不锈钢(尼龙)的筛网；平皿、三角烧瓶、吸管、离心管、培养瓶、载玻片。

3．消化分离法的操作步骤(以消化为例)

()漂洗：将组织块在三角烧瓶(或平皿)中用无钙、镁PBS液洗2～3次。

(2)剪切：组织块剪碎，剪成3~5mm。大小的小块。

(3)消化：剪碎的组织块放人三角烧瓶中，加入比组织量多30~50倍的0．25％消化液。置于电磁搅拌器台上，消化30~60min，或置于37℃水浴锅(37℃温箱中)，中间每隔5～0 min可轻摇次，组织块膨松呈絮状可终止。如果需要长时间的消化可更换一次消化液，静止三角烧瓶0min，待组织下沉后，吸出2／3上清液，余下／3，再补加新的消化液，继续消化。

(4)消化完毕，倒入离心管中，800r／min离心6~8min，去上清液。

(5)漂洗：采用Hanks液漂洗2~3min，离心去上清液，共2次。

(6)低速离心(500~000r／min)：离心5min，去上清液，加入一定量的培养液，通过00μm的网眼的尼龙网或不锈钢纱网滤过，以除去未消化的较大组织块；如果消化*可不用滤过。用吸管吸取一滴细胞悬液滴于载玻片上观察，如果细胞分散良好，形态整，即可用于培养。

4．注意事项

()组织块必须漂洗2～3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对的抑制作用。

(2)浓度高对细胞有毒性，浓度不宜过高；作用时间不能太长，以避免毒性作用。

(3)消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻以避免蓬松的细胞随漂洗而丢失。