SP三步法操作步骤

操作步骤：

、脱蜡：60℃ 20min；二甲苯I0min 、二甲苯II0min。

2、梯度酒精脱水：00%EtOH I 5min 、00%EtOH II 5min、95%EtOH 3min、80% EtOH 3min、70% EtOH 3min。抗体

3、灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 常温下避光孵育0min，PBS冲洗3次×3min；

4、抗原修复：置0.0M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（微波炉可高火4次×6min），自然冷却30min 以上，至室温后PBS冲洗3次×3min。

5、封闭：用封闭液（一般与二抗来源一致，如正常羊血清工作液）封闭，常温下0~30min，倾去勿洗。

6、一抗孵育：滴加适宜浓度的一抗4℃ 冰箱孵育过夜（zui常用），37℃复温45min，PBS冲洗5次×3min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；

7、二抗孵育：滴加标记二抗，37℃孵育30min, PBS冲洗5次×3min；

8、SP反应：滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗5次×3min；

9、DAB显色：配置DAB/H2O2反应液孵育组织切片，镜下控制染色，一般3~0min，自来水充分冲洗；

0、苏木素复染：一般胞浆蛋白或胞膜蛋白可以适当染至几十秒~几分钟，但细胞核蛋白在几秒。若过染，可以用%HCl褪色；抗体

、常规脱水：50% ethanol -2min、70% ethanol -2min、95% ethanol -2min、95% ethanol -2min、00% absolute ethanol: （-2）min、00% absolute ethanol: （-2）min；

2、透明：Xylene ×（-2）min→Xylene 2×（-2）min；

3、封片：中性树胶。

注意事项

、苏木素复染时间需要摸索，尤其阳性染色也在细胞核上。

2、DAB显色时间需要达到*化，镜下观察达到阳性染色明显但背景不太深。

3、抗体孵育时间和抗体浓度需要摸索。尤其一抗孵育在4度过夜。

4、切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，但又防止干片；用组化笔画圈时尽量画大一点，否则墨水排斥液体，引起片周边干片。