小鼠Treg检测操作步骤

、在每个流式上样管中加入00 μl准备好的细胞悬液，细胞数约为x06个.

2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体00 μl体系中使用0.25 μg FITC anti-mouse CD4，0.06 μg APC anti-mouse CD25抗体。根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 

3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。

4、旋涡震荡重悬细胞后加入ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（:3稀释好），并再次旋涡混匀。

5、避光4℃孵育30分钟到8小时（孵育30分钟到8小时，结果一样）。

6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。

7、重复第6步操作洗涤细胞。

8、（可选）加入含0.5 μg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证00 μl体系4 ℃孵育5分钟。

9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 μg PE anti-mouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的zui适浓度。

0、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

、重复上一步洗涤细胞。

    用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化。