结果分析与鉴定
(一)细胞观察
.在倒置相差显微镜下,当细胞长满瓶底时,典型的平滑肌细胞为梭形,平行呈束状排列,密集与稀疏交叉呈“峰”与“谷”状,峰处细胞密集、多层;谷处细胞稀疏甚至没有细胞。
2.电镜下观察,可把平滑肌细胞分为“合成型”与“收缩型”两型。前者胞质充满楹面内质网,但粗肌丝或细肌丝很少,肌动蛋白的抗体荧光染色为阴性,细胞无收缩功能。“收缩型”细胞是平滑肌细胞的典型表现,主要特征为胞质内有束状肌丝,细胞有收缩功能。
3.原代培养的zui初周内细胞以“收缩型”为主,以后逐渐向“合成型”转化且大量繁殖。传代培养zui初从“收缩型”向“合成型”转化很快,6~0d后又复原,但已无收譬功能。
(二)MTT比色法
.MTT能进入活的线粒体内,与各种脱氢酶反应,可用于测定细胞的成活及增殖。
2.以PBS溶解MTT制成5mg/ml溶液,抽滤灭菌。按每孔00μl培养液加入0μl的量把MTT加入细胞培养孔内,在37℃继续培养4 h。
3.取出培养板,吸出孔中培养液,每孔加入00μl酸性异丙醇(含0.04 ml/L HCl),使深蓝色结晶*溶解。
4.在室温下放置数分钟,确认结晶*溶解后即把培养板在570 nm、630 nm处.控l设在.99(如样品着色过强,则设在.00)的多7L扫描分光光度计下读数。在加入异丙后l h内测定完毕。
5.也可以使用DMSO每孔320μl代替异丙醇溶解细胞内MTT,在酶联免疫测定仪上司570nm或570 nm、630 nm双波长处测定吸光值并分析。
(三)3 H-TdR放射免疫测定
.将待测细胞吸去培养液,每孔加入含3 H—TdR的培养液200μl(含放射量3.7×0 4Bq),37℃孵育24 h后终止培养。
2.以冷PBS200μl清洗3次,加入4℃的0%TCA 200 μl,放于4℃冰箱内30 min。
3.吸去TCA,加入乙醚一乙醇(:2)混合液200μl漂洗,吸去液体,晾干。
4.加入O.4 mol/L NaOH溶液每孔200μl溶解细胞,在56℃恒温箱中放置2h。
5.吸出全部液体,注入含有5ml闪烁液的闪烁瓶中,加盖摇匀,放置2h后进行液闪测定。
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