双抗体夹心法与间接法

双抗体夹心法：

() 包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为～0μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

(2) 加样：加一定稀释的待检样品0.ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

(3) 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.ml。37℃孵育0.5～小时，洗涤。

(4) 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.ml，37℃0～30分钟。

(5) 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

(6) 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+"、“-"号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则40nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.倍，即为阳性。

间接法：

    用包被缓冲液将已知抗原稀释至～0μg/ml，每孔加0.ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,zui后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法"的4、5、6。