细胞悬液的制备

(一)实验方法

．细胞悬液的制备 将生长成单层的细胞，除去培养基，HBSS洗涤后，用0．02以EDTA或0．％溶液(无Ca 2+ 、Mg 2+之磷酸缓冲液中)37℃消化细胞。冉用HBSS浼涤次，加入适量生长用培养基，反复吹吸，制成单细胞悬液，并计数。

2．UDS的放射自显影显示法

()将单细胞悬液接种于置有小盖玻片(8mmX 6mm)的培养瓶中。37℃培养～3d，使细胞在盖玻片上生长至适当密度。

(2)改换同步化培养基(ADM补以％小牛血清)作同步培养3－－4d。

(3)在实验前一日下午，改换含有0mmol／。(HU)的ADM培养基，37℃曩续孵育6h。

(4)将上述长有细胞的盖玻片置于含有待检样品或已知致癌物的同步用培养基(含0mmmol／L HU及5～lOμci／ml，30Ci／mmol 3 H一胸腺嘧啶核苷)中，37℃孵育5h。检品及已知致癌物溶液在实验时新鲜配制，以溶剂及已知致癌物为对照。

(5)孵育结束后，用HBSS充分洗涤，用％溶液处理0min，随后用乙醇冰乙酸(3：)固定，4℃过夜。

(6)空气中干燥后，用少量中性树胶，将盖玻片粘固于载玻片上，细胞面朝上，45℃烘烤24h。

(7)在暗室中，将适量乳胶移入浸渍用玻璃器皿中，置于40℃水浴中令其融化，同时取等量蒸馏水于量筒中也置于该水浴中加热，待乳胶融化后，将热蒸馏水倾于乳胶液中，继续在水浴中加温，并用玻璃棒轻轻搅拌，等待lO～20min，使气泡逸出。在以上准备过程中，将待检玻片置于水浴平台上预热。准备就绪后，将玻片垂直浸渍于：稀释的乳胶液中约5s，徐徐提出玻片，并用纱布或擦镜纸拭去玻片背面乳胶。

(8)将已涂有乳胶的玻片移入温度为29℃及一定湿度的温箱中(4h)待乳胶干涸。

(9)将玻片置于内含适量干燥剂(变色硅胶)的曝光盒中。曝光盒外包以黑色避光纸及塑料纸，置于4℃冰箱中曝光0d。

(0)曝光结束后，将玻片移人有机玻璃制成的玻片架上，在液温为9℃的D一96显影液中显影5min，在停显液中漂洗2min，在F一5定影液中定影6～lOmin，再用水漂洗数小时。

()将玻片脱水透明后，用盖玻片封固。

(2)在显微镜下，每个处理组计数各样本细胞核上的显影银粒数，同时计数相当面积的本底银粒数，并自核上的银粒数减去。计数30～50个细胞核。

3．LTDS的液体闪烁计数显示法

()将单细胞悬液按0．5×05个／ml浓度接种于液体闪烁计数瓶中，每瓶ml，并加入4C一胸腺嘧啶核苷终浓度为O．0μci／ml(50mCi／mmol)。37℃于细胞增殖培养基中培养48h使细胞增殖并预标。

(2)去培养基并用HBSS洗涤后，换以含4c胸腺嘧啶核苷(O．0μci／m)的同步化培养基，37℃进行同步化培养2～4d。

(3)实验前一日下午去培养基，用HBSS充分洗涤后，加入含有浓度为0mm0／L羟基碌(HU)的同步化培养基，37℃孵育6h。

(4)将上述长有细胞的盖玻片置于含有Hu及3 H胸腺嘧啶核苷(5μCi／ml，30Ci／mmol)的同步化培养基中，与不同浓度的检品及已知致癌物接触5h。检品及已知致癌物溶液在实验时新鲜配制，以溶剂及已知致癌物为对照。

(5)孵育结束后，去培养基及检品。冷盐水洗涤2次，随后用冰冷的O．25mol／L过氯酸溶液处理2次，每次2min，以固定细胞并除去酸可溶性成分。

(6)乙醇处理0min除去脂溶性成分及未掺入的标记物，干后以O．5～lmol／L过氨酸0.5ml，于75～80℃恒温箱中水解40min，使掺人的标记物释出。

(7)冷却后加入乙二醇乙醚3．5ml及53ml闪烁液，振摇后使呈匀相，以液体闪烁计数器测定各样本中4c及3 H的放射活性。标本中的3 H放射活性即反映UDS中3 H一胸腺嘧啶核苷的掺人量；而4 c的放射活性反映实验细胞的数目或其DNA量，因此3 H和4c放射活性比(3 H/4 c)即为单位质量DNA或单位数目细胞中UDS水平的反映值。

二、结果判断

    可用Student氏“t”检验检测各检品与溶剂对照间有无显著性差异而作出判断。

    试验组处理的细胞3 H一胸腺嘧啶核苷掺人数随待检样品剂量增加而增加，且有统计学意义，或者zui小剂量组反应阳性，与对照组比较具有统计学意义，均可判定为该试验阳性。受试物组处理的细胞3H一胸腺嘧啶核苷掺人数不随待检样品剂量增加而增加，任何一个剂量组与对照组无统计学上的差异，则认为受试物在该试验系统不引起UDS。判定结果时，应综合考虑生物学意义和统计学意义。