重组体克隆的筛选与鉴定

重组体克隆的筛选与鉴定

    由体外重组产生的DNA分子，通过转化、转染、转导等适当途径引入宿主会得到大量的重组体细胞或噬菌体。然而在这些众多的重组体中，会有多种类型的DNA分子，其中包括：不带任何外源DNA插入片段，仅是由线性载体分子自身连接形成的环状DNA分子；由一个载体分子和一个或数个外源DNA片段构成的重组体DNA分子；单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。当然zui后这类多聚DNA分子由于不具备复制起点和复制基因，不能在转化子中存留，zui后被消耗掉成为无用的分子。尽管如此，面对由这种混合的DNA制剂转化而来的大量的克隆群体，需要采用特殊的方法才能筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。同时也需要用某种方法检测从这些克隆中提取的质粒或噬菌体DNA，看其是否确实具有一个插入的外源DNA片段。即便在这一问题得到了证实之后，也还不能肯定这些重组载体所含有的外源DNA片段就一定是编码所研究的目的基因的序列。为解决这一系列的问题，从为数众多的转化子克隆中分离出含有目的基因的重组体克隆，需要建立一整套行之有效的特殊方法。

    目前已经发展和应用了一系列构思巧妙、可靠性较高的重组体克隆检测法，包括使用特异性探针的核酸杂交法、免疫化学法、遗传检测法和物理检测法等。细胞

遗传检测法

    遗传检测法可分为根据载体表型特征和根据插入序列的表型特征选择重组子两种方法。

根据载体表型特征选择重组体分子的直接选择法

    根据载体分子所提供的表型特征直接选择重组体DNA分子的遗传选择法是一种十分有效的方法，当它与微生物学技术相配合时便可适用于大量群体的筛选。在基因工程中使用的所有的载体分子都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性标记或营养标记，而对于噬菌体来说，噬菌斑的形成则是它们的自我选择特征。根据载体分子所提供的遗传特征进行选择，是获得重组体DNA分子群体的*的条件之一。正如已经叙述过的，这种遗传选择法能将重组体的DNA分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。抗生素抗性选择基因插入失活选择，或者是诸如β-半乳糖苷酶基因一类的显色反应，便是属于这种依据载体编码的遗传特性选择重组体分子的典型方法。细胞