特异噬菌体抗体的ELISA筛查

.特异噬菌体抗体的ELISA筛查（单克隆噬菌体ELISA）将目的蛋白片段包被在免疫吸附板上，经过5轮的扩增-吸附和洗脱。将zui后一轮洗脱得到的噬菌体感染TG大肠杆菌，梯度稀释菌液铺氨苄抗性琼脂板，从分割较好的克隆中随机挑选53个进行抗原结合的ELISA分析找到候选的克隆。

（）从琼脂板（D3）上接种单一克隆到40μl2×TY-AMP-GLU中，振荡培养37℃（250rpm）过夜。

（2）转移20μl到第2管的40μl2×TY-AMP-GLU，继续生长。37℃ 振荡培养直到OD60nm达到0.5。

（3）在第2管中加入8μlM3KO7辅助噬菌体。

（4）37℃放30min，然后37℃振荡h。80g离心0min，抽去上清。

（5）将沉淀重悬于40μl2×TY-AMP-KANA，30℃振荡培养过夜。

（6）80g离心0min，使用50μl上清用于噬菌体ELISA（方法见上面描述）。

（7）包板，每孔0μl抗原。抗原浓度为2μg/ml（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被过夜）。

（8）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封闭2h。

（9）用PBS洗一次，加入F6噬菌体上清50μl，用4% BSA-PBS补足0μl。

（0）37℃孵育h，弃去测试液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（）加入∶50稀释的HRP-anti-M3单抗偶联物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（2）每孔加入0μl显色液（0μg/mlTMB溶于0mmol/L乙酸钠中，pH6.0，使用前在50ml的该液中加入30%过氧化氢0μl），放置37℃孵育0min，蓝色形成。

（3）加入50μlmol/L硫酸终止反应，颜色变黄。

（4）在OD450nm处读数，减去OD650nm读数，记录数据。

2.交叉反应测试（考虑到筛选过程中抗原体系中存在BSA，所以测试抗体对BSA的交叉反应情况）

（）包板，每孔0μlBSA。抗原浓度为2%（50mmol/L包被，pH9.6，4℃包被过夜）。

（2）用PBS洗一次，用2% BSA-PBS每孔30μl，37℃封闭2h。

（3）用PBS洗一次，加入F6噬菌体上清50μl，用4% BSA-PBS补足0μl。（4）37℃孵育h，弃去测试液，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（5）加入∶50稀释的HRP-anti-M3单抗偶联物，37℃孵育h，PBS-0.05% Twen-20洗5次。

（6）每孔加入0μl显色液（0μg/mlTMB溶于0mmol/L乙酸钠中，pH6.0，使用前在50ml的该液中加入30%过氧化氢0μl），放置37℃孵育0min，蓝色形成。

（7）加入50μlmol/L硫酸终止反应，颜色变黄。

（8）在OD450nm处读数，减去OD650nm的读数，记录数据。

3.竞争性抑制实验候选克隆进行竞争性ELISA分析，找到特异的目的克隆。

4.阳性克隆的质粒提取在含有筛选功能的培养板（如氨苄抗性或抗性）上挑取单菌落，在含同样筛选抗性的LB培养基中培养过夜。然后用普通的质粒提取法提取质粒。抗体

5.阳性克隆的菌液或质粒送测序