传代培养细胞的方法

方法

()培养细胞：取处于指数生，用较大平皿培养的，80％～90％汇合单层培养细胞。

(2)加秋水仙素：使用zui终浓度为O．02～O．8gg／ml营养液；温箱继续培养6～0h；麦用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6～2h后，再于37℃温箱中继续培养6～0h处理(加秋水仙素)。

(3)采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲洗，应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落；注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。

(4)离心：收集培养液，000r／min离心5～lOmin。

(5)低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0．075 mol／L KCl溶液，在温箱中静置
20～30min．

(6)预固定：向悬液中加新鲜：3醋酸、甲醇固定液lml，用吸管吹打均匀；此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。

(7)固定；离心，同(4)，吸除上清液，加新鲜固定剂5~0ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上·使之慢慢流人离心管中，然后轻轻吹打均匀，置5~20min。

(8)重复(7)，末次离心后，小心吸除大部上清液，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0．5～ml。

(9)制片：用滴片法制片，按如下步骤：*洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储存备用。滴片前先从冰箱中取出冷载物片张，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液(如固定液不散，可能因载物片未洗净或不冷所致)·滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用(做显带或荧光观察等)或立即进行染色观察。

(0)染色和封片：一般常用Giemsa染色；取干液Giemsa 份加pH6．8磷酸缓冲液9份混合，染色0min后，水洗、晾干、可直接观察(使用油浸镜)；如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片(或先迅速过丙酮两次，每次30s)后，再过二甲苯，然后封片亦可。